Este video te mostrará cómo pasar PSCs con EDTA en Medio Essential 8 en placas recubiertas de vitronectina.
El siguiente protocolo utiliza una placa de 6 pocillos. Si estás utilizando otro tipo de recipiente para cultivo celular, consulta la tabla 2 en el protocolo escrito para los volúmenes.
Hay tres diferencias principales que observarás con las células cultivadas en Medio Essential 8 sobre vitronectina en comparación con otros sistemas libres de alimentadores como mTeSR y StemPro hESC SFM:
• Las células generalmente se pasan ~24 horas antes que con otros medios libres de alimentadores.
• El pasaje debe realizarse cuando las células están al ~85% de confluencia. Si las células se pasan cuando están más del 85% confluentes, la salud de las células y el rendimiento final pueden verse comprometidos.
• Las células deben pasarse en EDTA. No se recomienda el colagenasa ni el dispasa.
Las células alcanzarán una confluencia óptima generalmente cada cuatro a cinco días.
También debes dividir cultivos o pasar células cuando las colonias de PSC se vuelven demasiado densas o grandes o muestran una diferenciación aumentada.
La relación de división puede variar, aunque generalmente está entre 1:2 y 1:4 para pasajes tempranos y entre 1:3 y 1:12 para cultivos establecidos. Ocasionalmente, las células crecerán a un ritmo diferente y será necesario ajustar la relación de división.
Una buena regla es observar la última relación de división y ajustar la relación según la apariencia de las colonias de PSC. Si las células se ven saludables y las colonias tienen suficiente espacio, divide tus cultivos usando la misma relación. Si las colonias están demasiado densas y hacinadas, aumenta la relación; si están escasas, disminuye la relación.
Las líneas de PSC recién derivadas pueden contener una cantidad considerable de diferenciación hasta el pasaje 4. No es necesario eliminar material diferenciado antes del pasaje. Al propagar/dividir las células, la salud general del cultivo debería mejorar a lo largo de los pasajes tempranos.
Prepara 0.5 mM de EDTA combinando 50 μL de EDTA UltraPure 0.5 M, pH 8.0 con 50 mL de DPBS sin calcio ni magnesio. Filtra, esteriliza la solución y almacena a temperatura ambiente.
Calienta previamente el Medio Essential 8 completo y los recipientes de cultivo recubiertos de VTN-N a temperatura ambiente.
Aspira el medio gastado del recipiente que contiene PSCs y enjuaga el recipiente dos veces con DPBS sin calcio ni magnesio.
Agrega 0.5 mM de EDTA en DPBS al recipiente que contiene PSCs. Agita el recipiente para cubrir toda la superficie celular.
Incuba el recipiente a temperatura ambiente durante 5 a 8 minutos o a 37 grados Celsius durante 4 a 5 minutos. Cuando las células comiencen a separarse y redondearse, y las colonias parezcan tener agujeros al ser vistas bajo un microscopio, están listas para ser retiradas del recipiente.
Nota: En recipientes más grandes o con ciertas líneas celulares, esto puede tardar más de 5 minutos.
Aspira la solución de EDTA y agrega Medio Essential 8 pre-calentado al recipiente.
Retira las células de los pocillos mediante la inyección suave de medio y pipeteando las colonias. Evita crear burbujas.
Intenta trabajar con no más de 1 a 3 pocillos a la vez, y trabaja rápidamente para retirar las células después de agregar Medio Essential 8 a los pocillos, que neutraliza rápidamente el efecto inicial del EDTA. Algunas líneas se re-adheren muy rápidamente después de la adición del medio y deben ser retiradas un pocillo a la vez. Otras son más lentas en re-adherirse y pueden ser retiradas 3 pocillos a la vez.
Recoge las células en un tubo cónico de 15 mL. Puede haber parches evidentes de células que no fueron deslodadas y quedaron atrás. No rasques las células del plato en un intento de recuperarlas.
Agrega un volumen apropiado de Medio Essential 8 pre-calentado a cada pocillo de una placa de 6 pocillos recubierta de vitronectina para que cada pocillo contenga 2 mL de medio después de haber agregado la suspensión celular.
Mueve el recipiente en varios movimientos rápidos en forma de ocho para dispersar las células sobre la superficie de los recipientes. Coloca el recipiente suavemente en el incubador a 37 grados Celsius y 5% de CO2 e incuba las células durante la noche.
Alimenta las células PSC con Medio Essential 8 comenzando el segundo día después de la división y reemplaza el medio gastado diariamente.
Es normal ver restos celulares y pequeñas colonias después del pasaje.
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