Dieses Video zeigt Ihnen, wie Sie PSCs mit EDTA in Essential 8 Medium auf vitronectin-beschichteten Platten passagieren.
Das folgende Protokoll verwendet eine 6-Well-Platte. Wenn Sie einen anderen Typ von Zellkulturgefäß verwenden, beachten Sie bitte Tabelle 2 im schriftlichen Protokoll für die Volumina.
Es gibt drei wesentliche Unterschiede, die Sie bei Zellen, die in Essential 8 Medium auf Vitronectin kultiviert werden, im Vergleich zu anderen feederfreien Systemen wie mTeSR und StemPro hESC SFM beobachten werden:
• Zellen werden typischerweise etwa 24 Stunden früher passagiert als mit anderen feederfreien Medien.
• Das Passagieren sollte erfolgen, wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 85 % erreicht haben. Wenn Zellen passagiert werden, wenn sie mehr als 85 % konfluente sind, kann die Gesundheit der Zellen und der endgültige Zellenausstoß beeinträchtigt werden.
• Zellen müssen in EDTA passagiert werden. Collagenase und Dispase werden nicht empfohlen.
Zellen erreichen typischerweise alle vier bis fünf Tage eine optimale Konfluenz.
Sie sollten auch Kulturen teilen oder Zellen passagieren, wenn PSC-Kolonien zu dicht oder zu groß werden oder eine erhöhte Differenzierung zeigen.
Das Teilungsverhältnis kann variieren, liegt jedoch normalerweise zwischen 1:2 und 1:4 für frühe Passagen und zwischen 1:3 und 1:12 für etablierte Kulturen. Gelegentlich wachsen Zellen unterschiedlich schnell, und das Teilungsverhältnis muss angepasst werden.
Eine gute Regel ist, das letzte Teilungsverhältnis zu beobachten und das Verhältnis entsprechend dem Erscheinungsbild der PSC-Kolonien anzupassen. Wenn die Zellen gesund aussehen und die Kolonien genügend Platz haben, teilen Sie Ihre Kulturen mit demselben Verhältnis. Wenn die Kolonien zu dicht und überfüllt sind, erhöhen Sie das Verhältnis; wenn sie spärlich sind, verringern Sie das Verhältnis.
Neu abgeleitete PSC-Linien können bis zur Passage 4 einen erheblichen Anteil an Differenzierung aufweisen. Es ist nicht notwendig, differenziertes Material vor dem Passagieren zu entfernen. Durch das Vermehren/Teilen der Zellen sollte die allgemeine Gesundheit der Kultur in den frühen Passagen verbessert werden.
Bereiten Sie 0,5 mM EDTA vor, indem Sie 50 μL UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 mit 50 mL DPBS ohne Calcium und Magnesium kombinieren. Filtern Sie die Lösung, sterilisieren Sie sie und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.
Erwärmen Sie das vollständige Essential 8 Medium und die mit VTN-N beschichteten Kulturgefäße auf Raumtemperatur.
Entfernen Sie das verbrauchte Medium aus dem Gefäß mit den PSCs und spülen Sie das Gefäß zweimal mit DPBS ohne Calcium und Magnesium.
Fügen Sie 0,5 mM EDTA in DPBS zu dem Gefäß mit den PSCs hinzu. Schwenken Sie das Gefäß, um die gesamte Zelloberfläche zu beschichten.
Inkubieren Sie das Gefäß bei Raumtemperatur für 5 bis 8 Minuten oder bei 37 Grad Celsius für 4 bis 5 Minuten. Wenn die Zellen anfangen, sich zu trennen und rund zu werden, und die Kolonien unter dem Mikroskop Löcher aufweisen, sind sie bereit, aus dem Gefäß entfernt zu werden.
Hinweis: In größeren Gefäßen oder bei bestimmten Zelllinien kann dies länger als 5 Minuten dauern.
Entfernen Sie die EDTA-Lösung und fügen Sie vorgewärmtes Essential 8 Medium zu dem Gefäß hinzu.
Entfernen Sie die Zellen aus dem/den Well(s), indem Sie vorsichtig Medium spritzen und die Kolonien aufpipettieren. Vermeiden Sie es, Blasen zu erzeugen.
Versuchen Sie, nicht mehr als 1 bis 3 Wells gleichzeitig zu bearbeiten, und arbeiten Sie schnell, um die Zellen zu entfernen, nachdem Sie Essential 8 Medium zu dem/den Well(s) hinzugefügt haben, da dies schnell die anfängliche Wirkung von EDTA neutralisiert. Einige Linien haften sehr schnell nach der Zugabe von Medium wieder an und müssen 1 Well nach dem anderen entfernt werden. Andere haften langsamer wieder an und können 3 Wells gleichzeitig entfernt werden.
Sammeln Sie die Zellen in einem 15-mL konischen Röhrchen. Es kann offensichtliche Bereiche von Zellen geben, die nicht gelöst wurden und zurückgelassen wurden. Schaben Sie die Zellen nicht aus der Schale, um sie zurückzugewinnen.
Fügen Sie ein angemessenes Volumen vorgewärmtes Essential 8 Medium zu jedem Well einer vitronectin-beschichteten 6-Well-Platte hinzu, sodass jedes Well nach Zugabe der Zellensuspension 2 mL Medium enthält.
Bewegen Sie das Gefäß in mehreren schnellen Achtbewegungen, um die Zellen gleichmäßig über die Oberfläche der Gefäße zu verteilen. Stellen Sie das Gefäß vorsichtig in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 und inkubieren Sie die Zellen über Nacht.
Füttern Sie die PSC-Zellen mit Essential 8 Medium ab dem zweiten Tag nach dem Teilen und ersetzen Sie das verbrauchte Medium täglich.
Es ist normal, Zelltrümmer und kleine Kolonien nach der Passage zu sehen.
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