Este vídeo mostrará como passar PSCs com EDTA em Essential 8 Medium em placas revestidas com vitronectina.
O seguinte protocolo utiliza uma placa de 6 poços. Se você estiver usando outro tipo de recipiente para cultura celular, consulte a tabela 2 no protocolo escrito para volumes.
Existem três diferenças principais que você observará com células cultivadas em Essential 8 Medium em Vitronectina em comparação com outros sistemas sem suporte, como mTeSR e StemPro hESC SFM:
• As células geralmente são passadas ~24 horas antes do que seriam com outros meios sem suporte.
• A passagem deve ocorrer quando as células estiverem com ~85% de confluência. Se as células forem passadas quando estiverem mais de 85% confluentes, a saúde das células e o rendimento final podem ser comprometidos.
• As células devem ser passadas em EDTA. Colagenase e Dispase não são recomendadas.
As células atingirão a confluência ideal geralmente a cada quatro a cinco dias.
Você também deve dividir culturas ou passar células quando as colônias de PSC se tornarem muito densas ou grandes ou apresentarem diferenciação aumentada.
A proporção de divisão pode variar, embora geralmente esteja entre 1:2 e 1:4 para passagens iniciais e entre 1:3 e 1:12 para culturas estabelecidas. Ocasionalmente, as células crescerão em uma taxa diferente e a proporção de divisão precisará ser ajustada.
Uma boa regra é observar a última proporção de divisão e ajustar a proporção de acordo com a aparência das colônias de PSC. Se as células parecerem saudáveis e as colônias tiverem espaço suficiente, divida suas culturas usando a mesma proporção. Se as colônias estiverem excessivamente densas e se aglomerando, aumente a proporção; se estiverem escassas, diminua a proporção.
Linhas de PSC recém-derivadas podem conter uma quantidade considerável de diferenciação até a passagem 4. Não é necessário remover material diferenciado antes da passagem. Ao propagar/dividir as células, a saúde geral da cultura deve melhorar ao longo das passagens iniciais.
Prepare 0,5 mM de EDTA combinando 50 μL de UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 com 50 mL de DPBS sem Cálcio e Magnésio. Filtre, esterilize a solução e armazene em temperatura ambiente.
Aqueça o Essential 8 Medium completo e os recipientes de cultura revestidos com VTN-N até a temperatura ambiente.
Aspire o meio gasto do recipiente contendo PSCs e enxágue o recipiente duas vezes com DPBS sem cálcio e magnésio.
Adicione 0,5 mM de EDTA em DPBS ao recipiente contendo PSCs. Agite o recipiente para cobrir toda a superfície celular.
Incube o recipiente em temperatura ambiente por 5 a 8 minutos ou a 37 graus Celsius por 4 a 5 minutos. Quando as células começarem a se separar e arredondar, e as colônias parecerem ter buracos quando vistas sob um microscópio, elas estão prontas para serem removidas do recipiente.
Nota: Em recipientes maiores ou com certas linhagens celulares, isso pode levar mais de 5 minutos.
Aspire a solução de EDTA e adicione o Essential 8 Medium pré-aquecido ao recipiente.
Remova as células do(s) poço(s) gentilmente, borrifando o meio e pipetando as colônias. Evite criar bolhas.
Tente trabalhar com no máximo 1 a 3 poços de cada vez e trabalhe rapidamente para remover as células após adicionar o Essential 8 Medium ao(s) poço(s), que neutraliza rapidamente o efeito inicial do EDTA. Algumas linhagens re-aderem muito rapidamente após a adição do meio e devem ser removidas 1 poço de cada vez. Outras são mais lentas para re-aderir e podem ser removidas 3 poços de cada vez.
Colete as células em um tubo cônico de 15 mL. Pode haver áreas óbvias de células que não foram deslodadas e deixadas para trás. Não raspe as células do prato na tentativa de recuperá-las.
Adicione um volume apropriado de Essential 8 Medium pré-aquecido a cada poço de uma placa de 6 poços revestida com vitronectina, de modo que cada poço contenha 2 mL de meio após a adição da suspensão celular.
Movimente o recipiente em vários movimentos rápidos em forma de oito para dispersar as células pela superfície dos recipientes. Coloque o recipiente suavemente no incubador a 37 graus Celsius, 5% de CO2 e incube as células durante a noite.
Alimente as células PSC com Essential 8 Medium começando no segundo dia após a divisão e substitua o meio gasto diariamente.
É normal ver debris celulares e pequenas colônias após a passagem.
#stemcellpassaging, #pscpassaging, #passagestemcells, #essential8medium, #thermofisherscientific