Quando falamos sobre "dividir" células, não estamos nos referindo a abrir as células ou algo do tipo - em vez disso, estamos pegando um grupo de células que estão crescendo muito próximas umas das outras e as dividindo em uma área/volume maior (como vários frascos ou placas ou pelo menos frascos maiores). Isso permite que elas continuem crescendo e se multiplicando sem ficar sem espaço ou alimento.
Divisão também é chamada de subcultivo ou, mais comumente, passagem. E quando adicionamos as células a um novo recipiente de crescimento, chamamos isso de "semeadura". É fácil fazer isso para células em suspensão (que podemos simplesmente diluir ou, se preferirmos, podemos centrifugá-las, remover o meio antigo e adicionar meio fresco primeiro). Para células aderentes (células que crescem grudadas à superfície de um recipiente de crescimento, como uma placa ou frasco), primeiro precisamos separá-las fisicamente dessa superfície (e umas das outras), tipicamente usando tripsina e EDTA. Mais sobre isso depois.
Determinamos quanto semear com base na "contagem de células" (determinando quão concentradas as células estão em uma amostra e usando isso para calcular quantas células temos) e calculando para semear uma quantidade que nos dará uma "densidade de semeadura" particular (por exemplo, 0,1 milhão de células por mL ou 3 milhões de células por placa de 10 cm) ou diluindo usando razões de semeadura (por exemplo, 1:2 significaria diluir pela metade, adicionando 1 parte da solução celular a 1 parte de meio novo).
As densidades e razões de semeadura ideais dependerão do tipo de célula (já que diferentes tipos de células têm diferentes tempos de duplicação e limites de densidade mínima/máxima) e dos seus planos para elas. Quanto mais você as dividir, mais tempo levará para elas multiplicarem de volta à sua densidade inicial. Portanto, se você quiser usá-las em breve, deverá dividi-las mais (por exemplo, 1:2), mas se não precisar delas por um tempo, você estará apenas mantendo um estoque e não quer ter que lidar com a passagem, deverá dividi-las menos (por exemplo, 1:10). Consulte as faixas recomendadas para o tipo de célula com o qual você está trabalhando!
Cada vez que dividimos células, aumentamos o número de passagem dessas células. Então, por exemplo, se começarmos com um estoque fresco de células e as dividirmos/passarmos/subcultivarmos uma vez, teremos um número de passagem de 1, que frequentemente escrevemos como P1. Em alguns dias (dependendo da densidade de semeadura), precisaremos passar novamente. Esta será a segunda passagem das células, então escreveremos "P2" em nossas anotações e em nosso frasco/placa. Na próxima vez será P3, etc.
É importante acompanhar o número de passagem porque as células continuamente adquirem mutações que podem afetar seu crescimento e/ou impactar seus resultados experimentais. Portanto, mesmo que você esteja lidando com uma linha celular "contínua", "imortal", que teoricamente poderia continuar crescendo e se dividindo para sempre, você deve manter seu número de passagem baixo e voltar a começar com um novo frasco de estoque se chegar a um número muito alto.
Isso é especialmente verdadeiro para linhas celulares "finitas", como linhas celulares primárias, que são mortais. Elas não podem crescer para sempre. Em vez disso, após um certo número de "duplicações populacionais" (PD), onde, em média, cada célula na cultura se dividiu uma vez, elas param de crescer (senescem). Como esse limite está relacionado ao PD (quantas vezes as células estão se multiplicando) em vez da passagem real (quantas vezes você está dividindo as células), pode ser mais útil acompanhar o PD para tais linhas celulares.
Mesmo que as células ainda não estejam senescendo, elas ainda estão passando por mudanças. Muitas vezes, para linhas celulares primárias, que têm uma identidade celular distinta (por exemplo, um tipo específico de célula do coração ou do cérebro), elas adquirem aleatoriamente mutações que facilitam o crescimento em cultura celular, mas as tornam menos semelhantes ao tecido original de onde vieram. Como essas mutações proporcionam uma vantagem de crescimento, essas células são selecionadas e superam as células mais distintas. Portanto, é importante monitorar as células de perto com um olhar cuidadoso para mudanças morfológicas (forma), etc., e manter o número de passagem baixo. Infelizmente, para linhas celulares finitas, as mutações iniciais são frequentemente as mais drásticas, à medida que as células se adaptam a crescer fora de seu habitat habitual. Para linhas celulares contínuas, elas já têm muitas mutações que permitem que cresçam facilmente, então as mutações adicionais que adquirem geralmente têm menos impacto.
Independentemente do tipo de célula, uma coisa chave a lembrar é que as mutações ocorrem aleatoriamente (e só então podem ser selecionadas com base nas vantagens de aptidão que permitem que elas "superem" suas vizinhas). Diferentes populações de células da mesma fonte celular original terão, portanto, combinações diferentes de mutações. Quanto mais próximo você estiver das células originais, menos tempo houve para divergir, então, ao manter um número de passagem baixo, você pode reduzir a variabilidade.
Falamos sobre a passagem excessiva como sendo "ruim", mas a passagem é crucial para a sobrevivência das células.
Como sabemos quando dividir as células? É melhor dividir quando as células estão na fase "log" tardia de crescimento.
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