Cette vidéo vous montrera comment passer des PSC avec de l'EDTA dans le milieu Essential 8 sur des plaques recouvertes de vitronectine.
Le protocole suivant utilise une plaque de 6 puits. Si vous utilisez un autre type de récipient de culture cellulaire, veuillez vous référer au tableau 2 du protocole écrit pour les volumes.
Il y a trois différences majeures que vous observerez avec des cellules cultivées dans le milieu Essential 8 sur vitronectine par rapport à d'autres systèmes sans support tels que mTeSR et StemPro hESC SFM :
• Les cellules sont généralement passées ~24 heures plus tôt que dans d'autres milieux sans support.
• Le passage doit avoir lieu lorsque les cellules sont à ~85 % de confluence. Si les cellules sont passées lorsqu'elles sont plus de 85 % confluentes, la santé des cellules et le rendement final peuvent être compromis.
• Les cellules doivent être passées dans de l'EDTA. La collagénase et la dispase ne sont pas recommandées.
Les cellules atteindront une confluence optimale généralement tous les quatre à cinq jours.
Vous devez également diviser les cultures ou passer les cellules lorsque les colonies de PSC deviennent trop denses ou trop grandes ou montrent une différenciation accrue.
Le rapport de division peut varier, bien qu'il soit généralement compris entre 1:2 et 1:4 pour les premiers passages et entre 1:3 et 1:12 pour les cultures établies. Parfois, les cellules croissent à un rythme différent et le rapport de division devra être ajusté.
Une bonne règle est d'observer le dernier rapport de division et d'ajuster le rapport en fonction de l'apparence des colonies de PSC. Si les cellules semblent saines et que les colonies ont suffisamment d'espace, divisez vos cultures en utilisant le même rapport. Si les colonies sont trop denses et se chevauchent, augmentez le rapport ; si elles sont clairsemées, diminuez le rapport.
Les lignées de PSC nouvellement dérivées peuvent contenir une quantité significative de différenciation jusqu'au passage 4. Il n'est pas nécessaire de retirer le matériel différencié avant le passage. En propageant/divisant les cellules, la santé globale de la culture devrait s'améliorer tout au long des premiers passages.
Préparez 0,5 mM d'EDTA en combinant 50 μL d'UltraPure 0,5 M d'EDTA, pH 8,0 avec 50 mL de DPBS sans calcium ni magnésium. Filtrez, stérilisez la solution et conservez à température ambiante.
Préchauffez le milieu Essential 8 complet et les récipients de culture recouverts de VTN-N à température ambiante.
Aspirez le milieu usé du récipient contenant des PSC et rincez le récipient deux fois avec du DPBS sans calcium ni magnésium.
Ajoutez 0,5 mM d'EDTA dans le DPBS au récipient contenant des PSC. Faites tourner le récipient pour recouvrir toute la surface cellulaire.
Incubez le récipient à température ambiante pendant 5 à 8 minutes ou à 37 degrés Celsius pendant 4 à 5 minutes. Lorsque les cellules commencent à se séparer et à se regrouper, et que les colonies semblent avoir des trous lorsqu'elles sont vues au microscope, elles sont prêtes à être retirées du récipient.
Remarque : Dans des récipients plus grands ou avec certaines lignées cellulaires, cela peut prendre plus de 5 minutes.
Aspirez la solution d'EDTA et ajoutez le milieu Essential 8 préchauffé au récipient.
Retirez les cellules des puits en projetant doucement le milieu et en pipetant les colonies. Évitez de créer des bulles.
Essayez de travailler avec pas plus de 1 à 3 puits à la fois, et travaillez rapidement pour retirer les cellules après avoir ajouté le milieu Essential 8 aux puits, qui neutralise rapidement l'effet initial de l'EDTA. Certaines lignées se réadhèrent très rapidement après l'ajout du milieu et doivent être retirées un puits à la fois. D'autres mettent plus de temps à se réattacher et peuvent être retirées 3 puits à la fois.
Collectez les cellules dans un tube conique de 15 mL. Il peut y avoir des zones évidentes de cellules qui n'ont pas été détachées et laissées derrière. Ne grattez pas les cellules du plat dans une tentative de les récupérer.
Ajoutez un volume approprié de milieu Essential 8 préchauffé à chaque puits d'une plaque de 6 puits recouverte de vitronectine afin que chaque puits contienne 2 mL de milieu après l'ajout de la suspension cellulaire.
Déplacez le récipient dans plusieurs mouvements rapides en forme de huit pour disperser les cellules sur la surface des récipients. Placez le récipient délicatement dans l'incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2 et incubez les cellules pendant la nuit.
Alimentez les cellules PSC avec le milieu Essential 8 à partir du deuxième jour après la division et remplacez le milieu usé quotidiennement.
Il est normal de voir des débris cellulaires et de petites colonies après le passage.
#passagedecellulessouches, #passagedepcs, #passagecellulessouches, #milieuessential8, #thermofisherscientific