Cuando hablamos de “dividir” células, no nos referimos a abrirlas o algo así; en cambio, estamos tomando un grupo de células que están creciendo demasiado juntas y las estamos separando en un área/volumen más grande (como varios frascos o platos o al menos unos más grandes). Esto les permite seguir creciendo y multiplicándose sin quedarse sin espacio o alimento.
La división también se conoce como subcultivo o, más comúnmente, pasaje. Y cuando añadimos las células a un nuevo recipiente de cultivo, lo llamamos “siembra”. Es fácil hacer esto con células en suspensión (que simplemente podemos diluir o, si lo preferimos, podemos centrifugarlas, eliminar el medio viejo y añadir medio fresco primero). Para las células adherentes (células que crecen adheridas a la superficie de un recipiente de cultivo como un plato o frasco), primero tenemos que separarlas físicamente de esa superficie (y entre sí), típicamente usando tripsina y EDTA. Más sobre esto más adelante.
Determinamos cuánto sembrar basándonos en “contar células” (determinar cuán concentradas están las células en una muestra y usar eso para calcular cuántas células tenemos) y calculando para sembrar una cantidad que nos dará una “densidad de siembra” particular (por ejemplo, 0.1 millones de células por mL o 3 millones de células por un plato de 10 cm) o diluyendo usando proporciones de siembra (por ejemplo, 1:2 sería diluir a la mitad añadiendo 1 parte de solución celular a 1 parte de medio nuevo).
Las densidades y proporciones de siembra óptimas dependerán del tipo de célula (ya que diferentes tipos de células tienen diferentes tiempos de duplicación y límites de densidad mínima/máxima) y de tus planes para ellas. Cuanto más las dividas, más tiempo tardarán en multiplicarse de nuevo hasta su densidad inicial. Así que si quieres usarlas pronto, querrás dividirlas alto (por ejemplo, 1:2), pero si no las necesitas por un tiempo, solo estás manteniendo un stock y no quieres lidiar con el pasaje, querrás dividirlas bajo (por ejemplo, 1:10). ¡Consulta los rangos recomendados para el tipo de célula con el que estás trabajando!
Cada vez que dividimos células, aumentamos el número de pasaje para esas células. Así que, por ejemplo, si comenzamos con un stock fresco de células y lo dividimos/pasamos/subcultivamos una vez, tenemos un número de pasaje de 1, que a menudo escribimos como P1. En unos días (dependiendo de la densidad de siembra), necesitaremos pasarlo de nuevo. Este será el segundo pasaje de las células, así que escribiremos “P2” en nuestras notas y en nuestro frasco/plato. La próxima vez será P3, etc.
Es importante llevar un registro del número de pasaje porque las células adquieren continuamente mutaciones que podrían afectar su crecimiento y/o impactar tus resultados experimentales. Por lo tanto, incluso si estás tratando con una línea celular “continua”, “inmortal”, que teóricamente podría seguir creciendo y dividiéndose para siempre, querrás mantener tu número de pasaje bajo y volver a comenzar con un nuevo vial de stock si llegas a un número demasiado alto.
Esto es especialmente cierto para las líneas celulares “finitas”, como las líneas celulares primarias, que son mortales. No pueden crecer para siempre. En cambio, después de un cierto número de “duplicaciones poblacionales” (DP), donde, en promedio, cada célula en el cultivo ha dividido una vez, dejan de crecer (senescen). Debido a que este límite está relacionado con la DP (cuántas veces se están multiplicando las células) en lugar del pasaje real (cuántas veces estás dividiendo las células), puede ser más útil llevar un registro de la DP para tales líneas celulares.
Incluso si las células aún no están senescente, todavía están experimentando cambios. A menudo, para las líneas celulares primarias, que tienen una identidad celular distinta (por ejemplo, un tipo específico de célula del corazón o del cerebro), adquieren aleatoriamente mutaciones que facilitan su crecimiento en cultivo celular pero las hacen menos similares al tejido original del que provienen. Dado que estas mutaciones proporcionan una ventaja de crecimiento, estas células son seleccionadas y superan a las células más distintivas. Por lo tanto, es importante monitorear las células de cerca con un ojo cuidadoso para cambios morfológicos (de forma), etc., y mantener el número de pasaje bajo. Desafortunadamente, para las líneas celulares finitas, las mutaciones tempranas son a menudo las más drásticas, ya que las células se adaptan a crecer fuera de su hogar habitual. Para las líneas celulares continuas, ya tienen muchas mutaciones que les permiten crecer fácilmente, por lo que las mutaciones adicionales que adquieren a menudo tienen menos impacto.
Independientemente del tipo de célula, una cosa clave a recordar es que las mutaciones ocurren aleatoriamente (y solo entonces pueden ser seleccionadas en función de las ventajas de aptitud que les permiten “superar” a sus vecinas). Diferentes poblaciones de células de la misma fuente celular original tendrán, por lo tanto, diferentes combinaciones de mutaciones. Cuanto más cerca estés de las células originales, menos tiempo ha pasado para divergir, así que al mantener un número de pasaje bajo puedes reducir la variabilidad.
Hemos hablado de que un exceso de pasajes es “malo”, pero el pasaje es crucial para la supervivencia de las células.
¿Cómo sabemos cuándo dividir las células? Es mejor dividir cuando las células están en la fase de “crecimiento logarítmico” tardía.